肝星状细胞与肝窦内皮细胞研究进展：生物学特性、培养方法指南

摘要

肝脏功能的稳定运行不仅依赖肝实质细胞，也高度依赖肝非实质细胞构成的复杂微环境。肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells，HSCs）和肝窦内皮细胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells，LSECs/LECs）是肝非实质细胞中非常关键的两类细胞，分别参与肝脏细胞外基质稳态、维生素A储存、肝纤维化进展、肝窦物质交换、微循环调节以及药物肝毒性反应等过程。本文围绕HSCs与LSECs的生物学特性、疾病研究价值、原代细胞培养流程、共培养模型构建及实验注意事项进行系统整理，为肝纤维化、代谢性肝病、药物安全性评价和体外肝脏模型研究提供参考。

关键词：肝星状细胞、肝窦内皮细胞、肝非实质细胞、HSCs、LSECs、LECs、原代肝细胞培养、肝纤维化模型、药物肝毒性、肝脏微环境、3D肝脏模型

一、肝非实质细胞为什么是肝病研究中的关键对象？

肝脏是人体重要的代谢、解毒和合成器官，其功能并不是由肝实质细胞单独完成，而是依赖多种细胞类型共同维持。除肝细胞外，肝脏中还存在大量肝非实质细胞（Non-parenchymal Cells，NPCs），包括肝星状细胞、肝窦内皮细胞、库普弗细胞以及胆管相关细胞等。这些细胞共同参与肝脏微环境构建、免疫调节、血流调控、细胞外基质重塑以及损伤修复过程，因此在肝病机制研究和药物研发中具有重要价值。

在肝非实质细胞中，肝星状细胞（HSCs）和肝窦内皮细胞（LSECs/LECs）尤其受到关注。HSCs是肝纤维化发生发展的核心效应细胞，在静息状态下主要负责维生素A储存和基质稳态维持，而在肝损伤刺激下会被激活并转化为肌成纤维细胞样细胞，进而大量分泌胶原和其他细胞外基质成分。LSECs则构成肝血窦内皮屏障，具有高度特化的窗孔结构和内吞能力，是肝脏物质交换、血液清除和微循环调节的重要参与者。由于二者在肝脏稳态、纤维化进展、药物肝毒性和肿瘤微环境中均具有关键作用，因此常被用于构建体外肝病模型、药物筛选模型以及多细胞共培养体系。

二、肝星状细胞（HSCs）：肝脏稳态与纤维化进展中的双重角色

肝星状细胞又称肝星形细胞，主要位于肝窦周隙，也就是Disse间隙内，处在肝细胞与肝窦内皮细胞之间。正常生理状态下，HSCs处于静息状态，其最突出的形态学特征是胞质中含有大量富含维生素A的脂滴。人体内相当比例的维生素A储存在肝星状细胞中，因此HSCs不仅是肝脏结构性细胞，也是维持维生素A稳态的重要细胞类型。

静息期HSCs具有多种生理功能。一方面，HSCs能够代谢和储存维生素A，参与机体维生素A平衡调节；另一方面，它们能够合成和分泌正常细胞外基质成分，例如IV型胶原和层粘连蛋白，从而维持肝窦周围基质结构稳定。除此之外，HSCs还可以分泌肝细胞生长因子（HGF）等信号分子，参与肝细胞再生调控，并可通过胞突收缩调节肝窦血流，进而影响门静脉压力和肝脏微循环状态。

当肝脏受到酒精损伤、代谢异常、胆汁淤积、炎症刺激或其他病原相关损伤因素影响时，HSCs会由静息状态转变为活化状态，并逐渐表现出肌成纤维细胞样特征。活化后的HSCs会丢失维生素A脂滴，增殖和迁移能力增强，同时大量分泌以I型胶原和III型胶原为主的异常细胞外基质，并释放多种促炎和促纤维化因子。这一过程是肝纤维化形成的核心环节，也是肝硬化等终末期肝病发生发展的重要基础。

人肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）

图1. 人肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）

三、HSCs在肝病机制研究中的应用价值

HSCs的激活被认为是肝纤维化发生的始动和中心环节，因此该细胞类型长期被用于肝纤维化机制研究。研究人员通常会围绕TGF-β/Smad、PDGF/ERK、Wnt、Notch以及氧化应激相关通路，观察不同刺激条件下HSCs的活化、迁移、增殖和胶原分泌变化，从而寻找潜在抗纤维化靶点。由于HSCs在活化后会显著上调α-SMA、I型胶原和多种基质重塑相关分子，因此这些标志物也常被用于判断体外模型中HSCs的活化程度。

在药物筛选研究中，HSCs可用于构建体外HSCs激活模型，用于评估候选化合物是否能够抑制HSCs增殖、降低胶原合成、调节基质沉积或诱导活化HSCs凋亡。相比单纯使用肝细胞进行毒性评价，加入HSCs后能够更好地模拟肝纤维化相关微环境，使模型更接近真实病理状态。

HSCs也常用于肝靶向递送研究。活化HSCs表面会高表达PDGF受体、整合素αvβ3等分子，因此研究人员可利用这些特征设计靶向载体，将抗纤维化药物更精准地递送至活化HSCs。除此之外，HSCs还参与肝癌微环境形成，并能通过分泌细胞外基质、细胞因子和趋化因子影响肿瘤细胞生长、侵袭和免疫微环境，因此也是肝癌机制研究中的重要细胞对象。

四、人原代肝星状细胞培养流程与关键控制点

人原代肝星状细胞的体外培养需要重点关注细胞复苏、接种密度、贴壁均匀性、培养基更换、形态观察以及传代时机。原代HSCs在体外培养过程中容易逐渐自发活化，因此实验设计时需要根据研究目的选择合适的培养时间和传代代次。如果研究目标是观察静息状态或早期活化过程，应尽量减少传代次数，并在较短时间内完成检测；如果研究目标是构建活化HSCs模型，则可根据实验需求采用特定刺激条件或延长培养时间。

在细胞复苏阶段，一般需要先将完全培养基预热至37℃，从液氮中取出冻存管后快速解冻，通常控制在1.5至2分钟左右，并避免液体浸没瓶盖。完成表面消毒后，将细胞悬液转移至含预热培养基的离心管中，并冲洗冻存管以尽量回收残留细胞。随后在室温条件下以500×g离心约5分钟，弃去上清后使用预热培养基轻柔重悬细胞沉淀。

铺板时需要先进行活细胞计数，并根据实验需求设置合适接种密度。原文方案中采用约5000个细胞/cm²作为参考接种密度。为了使HSCs分布均匀，可先加入部分培养基，再加入细胞悬液，接种后立即轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分散于培养表面，然后置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。由于HSCs贴壁速度较快，如果接种后不及时混匀，细胞容易集中分布在局部区域，影响后续生长和实验一致性。

培养维护阶段通常每3至4天更换一次预热的新鲜培养基，并每日在倒置显微镜下观察细胞状态。静息期HSCs多呈星形或多突起形态，激活后则逐渐变为梭形或肌成纤维样形态。随着培养时间延长，细胞形态和标志物表达会发生变化，因此需要结合实验目的判断是否继续培养、传代或冻存。当细胞融合度达到85%以上时，可根据实验计划进行传代或冻存操作。

肝星状细胞P1代ICC分析表征图（200倍）

图2. 肝星状细胞P1代ICC分析表征图（200倍）

在消化传代阶段，需要预热胰酶和完全培养基，弃去旧培养基后使用PBS洗涤细胞，一般洗涤2次以去除残余血清和代谢产物。随后按照培养面积加入适量胰酶，原文参考体积为0.038 mL/cm²，并在37℃条件下消化2至5分钟。待细胞变圆、边缘收缩并开始脱落后，加入完全培养基终止消化，收集细胞后离心并重悬，再按照4500至5000个细胞/cm²的密度重新接种。冻存时应提前预冷冻存液和冻存管，收集细胞后调整至目标浓度，分装进入冻存管，经程序降温盒在-80℃过夜后，再转移至气相液氮中长期保存。

五、肝窦内皮细胞（LSECs/LECs）：肝脏微环境中的物质交换与屏障细胞

肝窦内皮细胞是肝脏特有的血管内皮细胞，构成肝血窦的内皮衬里。与其他组织中的血管内皮细胞相比，LSECs具有明显的组织特异性，其中最重要的结构特征是细胞膜上分布大量窗孔结构，并且缺乏完整的内皮下基底膜。这种结构使LSECs成为哺乳动物体内高度特化、通透性极高的内皮细胞类型，有助于血浆中小分子物质在肝窦血液与Disse间隙之间快速交换。

LSECs不仅是被动的屏障细胞，还具有强大的内吞和清除功能。它们能够摄取血液中的大分子废物、衰老蛋白、糖基化终产物及其他循环颗粒，因此被认为是肝脏内重要的清道夫细胞之一。除此之外，LSECs还能通过分泌一氧化氮（NO）等旁分泌信号维持肝窦舒张状态，并帮助维持HSCs静息表型。当LSECs发生功能障碍或毛细血管化时，其窗孔结构减少甚至消失，内皮下基底膜逐渐形成，进而改变肝窦微环境，并促进HSCs活化和纤维化进展。

肝窦内皮细胞（Liver Endothelial Cells, LECs）

图3. 肝窦内皮细胞（Liver Endothelial Cells, LECs）

六、LSECs在肝纤维化、DILI和代谢性肝病研究中的作用

LSECs功能异常常常是多种肝病发生的早期事件。在肝纤维化研究中，LSECs毛细血管化被认为是一个重要病理改变，其表现为窗孔减少、基底膜沉积和内皮表型改变。这一过程通常可早于明显的HSCs活化出现，并通过改变肝窦微环境、减少NO信号和增强促纤维化信号，推动HSCs从静息状态转向活化状态。因此，在构建肝纤维化体外模型时，LSECs与HSCs之间的相互作用是非常重要的研究内容。

在药物肝毒性（DILI）研究中，LSECs同样具有重要价值。药物进入肝脏后会首先接触肝窦内皮屏障，因此LSECs损伤有时可早于肝细胞损伤发生。部分药物或其代谢产物可能通过影响内皮屏障功能、扰乱肝窦血流、改变内吞功能或诱导炎症反应，进一步放大肝脏损伤。因此，将LSECs纳入体外肝毒性评价模型，有助于提高模型对复杂肝脏反应的模拟能力。

LSECs还可用于肝靶向药物递送研究。由于其表面表达Stabilin-2、甘露糖受体等特定分子，研究人员可以利用这些受体介导的摄取特性设计靶向递送载体，从而探索药物或纳米颗粒在肝脏中的定位与清除机制。在代谢相关脂肪性肝病研究中，LSECs功能障碍也被认为参与脂质代谢异常、炎症放大和微循环紊乱，因此成为MAFLD/MASH相关研究中的重要细胞对象。

七、人原代肝窦内皮细胞培养流程与实验注意事项

人原代肝窦内皮细胞培养同样需要严格控制复苏、接种、培养维护、消化传代和冻存流程。由于LSECs属于高度特化的内皮细胞，体外培养过程中容易逐渐丢失部分体内特征，因此需要尽量缩短不必要的培养时间，并在合适窗口内完成表型验证和功能实验。

复苏阶段通常需要提前预热完全培养基，将液氮冻存管置于37℃水浴中快速解冻，至剩少量冰晶时即可取出，随后进行表面消毒并转移至含预热培养基的离心管中。为提高细胞回收率，可冲洗冻存管壁并合并细胞悬液，然后以500×g室温离心5分钟，弃去上清后用新鲜完全培养基轻柔重悬细胞沉淀。

铺板时可先在100 mm培养皿中加入适量完全培养基，再按照约5000个细胞/cm²的密度接种细胞，轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布，并补足培养基后置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。培养维护阶段通常每2至3天更换一次培养基，并每日观察细胞形态。正常LSECs多呈鹅卵石样排列，细胞边界较清晰；如果出现明显拉长、形态不均一或脱落增加，需要结合培养条件判断是否存在状态下降或过度传代问题。

当细胞融合度达到85%以上时，可进行传代或冻存。传代前需要预热培养基和胰酶/EDTA，弃去旧培养基后用PBS洗涤2次，再按培养面积加入适量胰酶，原文参考体积为0.05 mL/cm²。37℃孵育2至5分钟后，待细胞变圆并开始脱落，加入完全培养基终止消化，收集细胞后500×g离心5分钟，弃去上清并重悬，再按照4000至5000个细胞/cm²接种。冻存时应将冻存液和冻存管置于冰上预冷，按传代步骤收集细胞并离心，使用预冷冻存液重悬至目标浓度后分装，随后通过程序降温盒在-80℃过夜，并于次日转移至气相液氮中长期保存。

八、HSCs与LSECs共培养在体外肝脏模型中的意义

肝脏是一个高度复杂的器官，仅使用单一细胞类型通常难以完整模拟体内肝脏微环境。HSCs与LSECs之间存在密切的旁分泌调控关系：正常状态下，LSECs通过NO等信号帮助维持HSCs静息状态；而当LSECs发生毛细血管化或功能障碍时，HSCs更容易被激活并启动纤维化过程。因此，将HSCs与LSECs进行共培养，有助于更接近体内病理过程地研究肝纤维化发生机制。

在肝纤维化体外模型构建中，HSCs与LSECs共培养能够模拟肝窦内皮损伤、毛细血管化和HSCs活化之间的连续变化。相比单独培养HSCs，共培养体系能够提供更复杂的细胞间信号，有助于研究肝纤维化早期事件、内皮-间质互作以及抗纤维化药物作用机制。在药物筛选方面，多细胞共培养模型也比单一细胞模型更接近真实肝脏微环境，可用于评估候选化合物对肝毒性、内皮损伤、纤维化标志物和细胞外基质沉积的综合影响。

随着3D培养、类器官和器官芯片技术发展，研究人员开始将HSCs、LSECs、肝细胞和库普弗细胞等多种细胞共同纳入体外模型中，以构建更完整的肝脏微环境。这类模型可用于再生医学研究、肝病机制分析、药物安全性评价、MASH/MAFLD研究以及肝脏类器官构建等方向。相比传统二维培养，多细胞三维体系能够更好地模拟组织结构、细胞互作和长期功能维持，因此有望成为未来肝病研究和药物研发中的重要工具。

九、FAQ：肝非实质细胞培养与研究常见问题

Q1：原代HSCs和LSECs可以传代多少次？

人原代HSCs在体外培养过程中会逐渐自发激活，因此通常不建议过多传代。若研究目标是观察较接近原代状态的细胞特征，一般建议尽量使用早代细胞，并控制传代次数。超过一定代次后，HSCs可能出现明显表型变化，影响后续实验结果。LSECs同样容易在体外培养过程中逐渐丢失部分特化内皮特征，因此也建议在较早代次和较稳定状态下开展功能实验。

Q2：为什么HSCs接种后需要立即轻轻晃动培养皿？

HSCs贴壁速度较快，如果接种后不及时轻轻晃动培养皿，细胞容易集中在培养皿中央或局部区域，导致细胞分布不均。细胞密度差异会影响增殖、形态变化和激活状态，也会影响后续免疫染色、药物处理和基因表达检测结果。因此，在接种后及时均匀分布细胞，是提高培养一致性的重要步骤。

Q3：如何判断HSCs是否处于激活状态？

HSCs激活状态可通过形态学观察和标志物检测共同判断。静息期HSCs通常含有脂滴，并高表达GFAP等相关标志物；随着细胞激活，脂滴逐渐减少，细胞形态由星形或多突起形态转变为梭形肌成纤维样形态，同时α-SMA、I型胶原和其他纤维化相关分子表达升高。因此，研究中常结合免疫荧光、qPCR、Western blot或转录组分析等方法判断HSCs激活程度。

Q4：如何验证LSECs的纯度和功能？

LSECs的纯度通常可通过内皮细胞标志物和LSECs相关标志物进行验证，例如CD31、vWF、LYVE-1等。功能方面，可通过内吞实验观察其摄取乙酰化低密度脂蛋白等能力，也可通过扫描电镜观察窗孔结构。由于LSECs在体外培养中容易发生表型改变，因此功能验证对于判断模型可靠性非常重要。

Q5：HSCs与LSECs共培养主要适合哪些研究？

HSCs与LSECs共培养适合用于研究肝纤维化早期机制、肝窦内皮毛细血管化、HSCs活化调控、药物肝毒性以及肝脏微环境重塑等方向。如果进一步加入肝细胞、库普弗细胞等其他细胞类型，还可以构建更复杂的肝脏类器官或肝脏芯片模型，用于药物安全性评价、代谢性肝病研究和体外疾病模型构建。

十、总结

肝星状细胞和肝窦内皮细胞是肝脏微环境中非常重要的两类肝非实质细胞。HSCs在维生素A储存、细胞外基质稳态和肝纤维化进展中发挥核心作用，而LSECs则通过窗孔结构、内吞功能和旁分泌信号调节肝脏物质交换、微循环以及HSCs状态。二者之间的相互作用构成了肝脏微环境稳态维持和病理改变的重要基础。

在肝病机制研究、药物肝毒性评价、MASH/MAFLD研究、肝纤维化模型构建以及3D肝脏模型开发中，HSCs与LSECs均具有较高应用价值。随着原代细胞培养、多细胞共培养、3D培养和器官芯片技术不断发展，研究人员将能够更接近真实人体肝脏环境地研究疾病机制和药物反应，从而提高体外模型的生理相关性和实验数据转化价值。

参考文献

1 Schwabe RF, Brenner DA. Hepatic stellate cells: balancing homeostasis, hepatoprotection and fibrogenesis in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2025.

2 Chen G, et al. Endothelial RAP1A attenuates sinusoidal capillarisation and liver fibrosis by inhibiting RAF1-mediated Notch activation. Gut, 2026.

关于技术资料来源

本文基于肝星状细胞（HSCs）、肝窦内皮细胞（LSECs）、肝非实质细胞（NPCs）、原代肝细胞培养、肝纤维化模型及药物肝毒性研究等公开文献与技术资料整理，仅用于科研信息分享与实验参考。文中涉及的细胞培养流程、细胞功能特征及研究应用方向，主要用于帮助研究人员了解肝非实质细胞在肝脏疾病机制研究、药物安全性评价、肝纤维化模型构建以及体外肝脏模型开发中的应用价值。